Circulation心肌梗死后保护性T

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调节性T细胞（Treg）在维持免疫平衡和调节炎症性疾病进展中至关重要，其可调控多种免疫细胞的激活及功能。目前越来越多的研究证明Treg细胞不仅有免疫调控作用，同时也发挥促进组织修复的功能。既往研究表明Treg细胞在抑制胰岛素抵抗，维持骨骼肌完整性中起保护作用。但是心肌梗死中，Tregs是否也产生适应性变化，发挥特殊作用，至今尚不明晰。

近期，华中科技大学同医院心血管内科程翔教授研究团队发现了心肌梗死后组织特异性Tregs类群，解析其相关基因表型、调控因子及功能，该研究结果发表于心血管领域顶级期刊《Circulation》中，题目为“AUniquePopulationofRegulatoryTCellsinHeartPotentiatesCardiacProtectionfromMyocardialInfarction”

结果解读：

Tregs累积于损伤心肌区域

首先研究者在小鼠心肌梗死后不同时间点采集心脏、脾脏及外周血中Tregs细胞进行流式分析，发现小鼠心肌梗死后第一天起心脏组织中Treg细胞数量开始增加，第7天达峰，持续升高至第14天。同样，心脏中CD4+T细胞以及心脏原始T细胞在心梗后7天达峰，其中CD4+T细胞中Treg细胞比例在心梗后7天逐渐升高，持续至心梗后28天，但脾脏及外周血中的Treg细胞则并未随时间发生显著动态改变。心脏缺血再灌注损伤及低温损伤模型中也观察到Treg细胞于1天内浸润损伤后心肌组织，且其数量高于外周血及脾脏中Treg细胞。

Figure1：心梗后Treg细胞于损伤心肌中累积

心脏中Treg细胞具有特殊转录组学特征

为探索心脏中Treg细胞的表型特征，研究者在小鼠心梗7天后分选出心脏、脾脏及非引流的淋巴结中原始T细胞与Treg细胞进行转录组测序。火山图显示心脏Tregs细胞与脾脏和非引流淋巴结中Tregs具有显著差异，但Tregs的激活特征并非二者间主要差异。其中皮肤及肌肉相关基因Ctla4,Areg,Illrl1亦在心脏Tregs细胞中上调，进一步分析上调基因发现多种细胞因子及细胞因子受体、趋化因子和相关受体基因如IL-10,IL4ra,Ifngr1,Irf1,Tnf,Tnfrsf9,Ccr2,Ccr7,Ccr8,Ccrl2和Cxcl10等显著上调。细胞外基质重构及胶原分泌相关基因，如Sparc,Dcn,Bgn,Mgp,Serpinh1,Postn,Col1a1,Col3a1和Fn1。基因集富集分析表明心脏中Treg细胞基因主要富集于细胞外结构/基质重塑、胶原代谢及胶原合成、伤口愈合及平滑肌细胞增殖等组织修复相关生物学过程。心梗后心脏中Treg细胞也不同于纵膈淋巴结（MLN）中Treg细胞,以上现在途径与MLN中treg相比在心脏中上调及富集更加显著。同样，在缺血再灌注模型中，心脏Tregs细胞也表现出以上特征。

Figure2：心脏Treg细胞具有特殊转录组特征

心梗后心脏中Treg细胞来源于外周循环

为确定心梗后心脏Treg细胞的来源，研究者用SIP1受体激动剂-FTY处理小鼠，使淋巴细胞停留于二级淋巴组织中。FTY处理后，缺血心脏中Treg细胞数量和比例在心梗后3天和7天显著下降，梗死区内CD4+T细胞浸润的数量也显著下降。说明心梗后心脏中Treg细胞可能来源于外周循环的Treg细胞。作者继续用kikGR/B6-ROSA转基因小鼠追踪Treg细胞和原始T细胞的迁移，发现与原始T细胞相比，Tregs细胞向缺血心脏中迁移指数更高，但纵膈淋巴结中Treg细胞迁移更多。

接下来，为研究循环中Treg细胞对心脏中Treg的贡献，研究者对CD45.1和CD45.2小鼠进行联体共生模型构建，并对CD45.1小鼠进行冠脉结扎，观察心梗后7天嵌合血Treg细胞情况。发现心脏中Treg细胞混合着血液中Treg细胞，说明梗死心脏区域中Treg细胞大部分来源于循环血。

Figure3：心脏Treg细胞源于外周循环

心脏中Tregs克隆性增殖，并具有特殊TCR克隆

除了从外周血涌入心脏，Treg细胞也可能再心梗后增殖并累积于损伤心肌区域。因此，研究者用免疫荧光技术对Treg中Ki67进行染色，发现心梗后7天约75%的Treg细胞均为Ki67阳性，其比例超过脾脏及非引流淋巴结中Treg细胞中比例。以EdU检测细胞增殖同样发现心脏中Treg细胞EdU阳性比例高于脾脏及非引流淋巴结。与淋巴器官原始T细胞相比，心脏中原始T细胞Ki67+及EdU+占比更高，但是仍低于心脏Treg细胞。这些结果表明，心脏中Treg具有高增殖性。为进一步探索心梗后心脏Treg细胞的克隆性，研究者对心梗后七天小鼠的CD4+T细胞进行了单细胞TCR测序分析，发现有一部分心脏Tregs具有克隆扩增特性，而脾脏中Treg细胞克隆扩增能力相对较差，且心脏与脾脏中Treg细胞共有的TCR序列相对有限。说明心脏Treg细胞具有特殊TCR序列特征。

Figure4：心脏Treg细胞具有克隆性增殖特征

少量心脏Treg细胞来源于原始T细胞

既往研究表明胸腺来源的Treg细胞为二级淋巴器官中Treg的重要来源。而一些原始T细胞在外周组织中获得Foxp3并转化为外周Treg细胞。本研究也发现许多心脏Treg细胞存在脾脏来源T细胞表型，因此研究者探索是否原始T细胞也为心脏Treg的来源。通过向心梗后CD45.1小鼠输送CD45.2原始T细胞，研究者发现2周后，可在受体小鼠淋巴器官及梗死心肌出检测到少量供体来源的Treg细胞。对心梗后心脏中原始T细胞进行TCR测序后，研究者亦找到与心脏Treg细胞相同的TCR克隆类型，表明原始T细胞可能转化为心脏中Treg细胞。

Figure5：少量心脏Treg细胞来源于原始T细胞

IL-33/ST2轴调控心脏Treg的累积与扩增

研究者试图探索Treg细胞在心梗后心脏累积的相关机制。发现上调基因Illrl1正是编码IL-33受体ST2的基因，并进一步通过RT-PCR方法证明该基因转录水平中上调。由于IL-33与Treg的稳态相关，研究者猜想心脏中Treg细胞的累积可能受到IL-33的调控。流式分析结果表明心脏中ST2+Treg细胞比例在心梗后3天显著升高并持续至心梗后28天，且心梗后IL-33在转录及蛋白水平检测到表达升高。为探索梗死心脏中IL-33的来源，研究者分选了心梗5天后CD45+及CD45-细胞并对其IL-33的转录物进行定量，发现IL-33主要表达与CD45-细胞中。对该类细胞进一步分为内皮、心肌细胞和心脏成纤维细胞，发现成纤维细胞主要表达IL-33，心肌细胞中表达量少，而内皮细胞中几乎检测不到IL-33的表达。进一步，研究者也通过免疫荧光染色证实这一现象。

最后，研究者通过敲除Illrl1及注射重组IL-33观察IL-33/ST2轴对心梗后心脏Treg细胞累积的调控。发现在Illrl1敲除后，心梗后7天心脏Treg细胞累积显著减少，而注射重组IL-33后，心脏中Treg细胞累积增多，脾脏中ST2+及Ki67+Treg细胞数量增多，进一步表明IL-33/ST2轴通过促进Treg细胞增殖。

Figure6：IL-33/ST2周调控心梗后心脏Treg细胞累积

心脏T细胞过表达Sparc可通过促进胶原沉积及瘢痕成熟抑制心梗后心脏破裂、延长生存时间

既往研究报导Treg细胞具有抑炎功能，但是否其组织特异性功能可直接影响梗死心肌修复尚不清楚。因此，研究者分析了心脏中Treg细胞的转录组特征，发现胶原连接蛋白基质细胞Sparc变化最显著，其在细胞外基质重构中起重要作用且IL-33也可促进Sparc表达升高。为探索Sparc基因是否影响心脏Treg细胞介导的心梗后心脏修复，研究者用CD25抗体减少Treg细胞，并运用慢病毒工具促进小鼠过表达Sparc。在CD25抗体处理组,Treg细胞在外周血中比例显著下降，而Sparc过表达后，Treg敲减小鼠心梗后心脏破裂发生率显著降低、其生存率与对照组小鼠相比显著升高。但心超检查发现Sparc过表达后小鼠心功能并无显著改善。研究者进一步

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