组培吧middot南天竹红叶南

导读：南天竹(Nandinadomstica)为小檗科南天竹属一种，常绿灌木，是观叶、观果的优良地被和色块植物。本文以红叶南天竹为试材，筛选出了有效的抑制内生菌的抑菌剂和适宜的组织培养基配方，建立了植株再生体系，为南天竹红叶无性系快繁奠定了基础。

1材料与方法

1.1外植体材料及培养条件

1.1.1材料预处理

从南天竹实生苗中选取健康、冬季嫩枝和叶色鲜红的植株作为实验材料。在采芽前1个月左右每隔7-10天整株喷洒倍多菌灵，然后采集新枝，剪除上面的羽状复叶，用自来水冲洗干净，用洗洁精溶液浸泡5-10min，再用自来水冲洗0.5h，备用。

1.1.2外植体消毒

将洗干净的外植体置于超净工作台上，用75%的酒精浸泡20-30s，倒掉酒精后加入0.1%升汞溶液，盖上瓶盖，其间不断摇动溶液，消毒8～10min后倒掉升汞溶液，然后用无菌水冲洗4～5次。以MS作为基本培养基，添加3%的蔗糖和0.7%的琼脂，pH5.8～6.0，附加各种植物调节剂，培养温度(25±2)℃，光照时间为12h/d，光强～lx。

1.2初代培养

消毒后用无菌刀剥取5mm左右大小的茎尖，迅速接入MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L培养基中，每瓶接种1个外植体，接种50瓶，重复3次。

1.3增殖培养

培养60天后，将小于0.5厘米的不定芽直接转接，大于0.5厘米新芽(梢)切割成0.5～1厘米左右的茎段转接，每瓶接种15个，接种50瓶，重复3次。培养60天观察增殖情况。

1.4内生菌抑制

植物体中的内生细菌潜伏得较深，表面消毒无法将其消除。这种污染在外植体初期培养中(前几代的继代培养)不易被肉眼察觉，随着继代次数的增加，植株体内细菌逐渐累积，在培养基上显现出来。

试验观察到，南天竹在组培过程中内生菌大体有两种表现形式:其一为接种20天左右培养基表面出现乳白色分布不均的小白点，然后逐渐干缩，与常见的细菌污染(脓状)或真菌污染(菌丝)状表现不同，并且不影响植株生长，仍能分割继代培养;其二为培养基内部接种茎段基部出现呈白色丝状或片状污染，随培养时间延长蔓延至培养基表面，基本不影响植株生长，但不能用于分割继代培养。

挑选培养基内部出现丝状内生菌感染的试管苗，采用切取茎尖，培养基中添加50%多菌灵可湿性粉剂和青霉素G－K等措施研究内生菌抑制效果。每瓶接种15个，接种30瓶，重复3次。培养60天，每隔10天观察污染情况。

1.5生根培养

1.5.1直接生根

将培养60天左右的试管苗3厘米以上的嫩茎切下，接入基本培养基为1/2MS的不同激素及不同pH值的培养基中，进行生根培养。诱导生根培养基中添加2%的蔗糖、0.7%的琼脂和0.2g/L活性炭。培养温度(25±2)℃，光照时间为12h/d(下同)，光强～lx。每瓶接种10株嫩茎，接种5瓶，重复3次。培养60天后，统计生根率。

1.5.2经壮苗培养后生根培养

将增殖阶段3厘米以上的嫩茎切下接入壮苗培养基中培养30天后转接到1/2MS+IBA0.25mg/L+NAA0.1mg/L+0.2g/L活性炭且pH为6.5的生根培养基中，培养60天统计生根率，观察壮苗培养基中细胞分裂素(6-BA)对生根率的影响。每瓶接种10株嫩茎，接种5瓶，重复3次。培养60天后，统计生根率。

2结果与分析

2.1外植体诱导结果

将5mm大小的茎尖接种到MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L培养基上，25天左右茎尖开始萌动并生长，50天左右有愈伤组织形成，60天左右愈伤组织中陆续有不定芽产生。

2.2芽的增殖培养

由表1可知，丛生芽的数量受6-BA浓度的影响明显，随6-BA浓度增高，愈伤组织增大，丛生芽增多，植株高度呈先增高后降低变化。

从表1可见，6-BA浓度为1.5mg/L时植株平均高度最高为4.6厘米，平均出芽数3.3个;当6-BA浓度高于1.5mg/L时，平均出芽数虽有提高，但植株平均高度下降且出现不同程度的玻璃化现象，叶柄极短，叶色变黄;当6-BA浓度为2.0mg/L时，愈伤呈白色球形水渍状，愈伤表面布满芽点。表中处理5即MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%是最佳的增殖配方，植株叶色鲜绿，无玻璃化现象，其增殖系数为7.3～10.3。

2.3内生菌抑制效果

2.3.1茎尖大小

表2可见，接种茎尖的大小对内生菌的抑制有一定的影响。茎尖小于0.2厘米时，培养数天后褐变死亡;茎尖长度0.2～0.5厘米时，培养后植株生长健壮，未观察到内生菌;茎尖长度大于0.5厘米时，培养时观察到内生菌出现;当接种茎段基部1厘米长茎段时，接种4天时即出现云雾状内生菌污染，10天后蔓延至培养基表面。试验表明，植物体不同部位的内生菌数量不同，基部内生菌积累较多，数量较大，生活力较强;而新梢部位生长较快，内生菌积累数量相对较少。

2.3.2添加青霉素G－K

选取轻微内生菌污染的试管苗，切取基部1厘米茎段接种到添加青霉素G-K50mg/L、75mg/L、mg/L的培养基上，60天后观察发现，3种不同青霉素G-K浓度的培养基都能有效抑制内生菌的生长繁殖，但表现有一定的差异。由表3可知，处理1即添加50mg/L的青霉素G－K的培养基是最佳的抑菌培养基，对植株生长无影响。

2.3.3添加50%多菌灵可湿性粉剂

选取轻微内生菌污染的试管苗，切取基部1厘米茎段接种到添加1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L的50%多菌灵可湿性粉剂的培养基上，培养60天后观察，添加不同浓度的50%多菌灵可湿性粉剂对内生菌的抑制及植株生长有一定的差异。0.5～1.5g/L的50%的多菌灵可湿性粉剂对植株生长有促进作用。但低浓度时(0.5g/L)时，不能完全抑制内生菌的发生;较高浓度(2.0g/L)虽然能抑制内生菌发生，但抑制植株生长。表4可知，添加1.5g/L50%多菌灵可湿性粉剂能有效抑制内生菌发生，并且不影响植株生长。

2.4生根培养

2.4.1直接生根效果

由表5可知，南天竹试管苗的生根率和生根数与培养基中的激素浓度，激素配比及培养基pH有一定的关系。培养基pH较高时，有利于提高生根率和生根条数;低浓度的IBA和NAA配合使用更加利于生根;随IBA浓度升高，生根率及生根数呈先升高后下降的趋势，较高浓度的IBA(0.5mg/L)促进愈伤组织的发生，诱导出的根短而脆，着生在愈伤组织上，不利于移栽成活。结果表明，当IBA浓度为0.25mg/L，NAA浓度为0.1mg/L，培养基pH为6.5时，直接生根效果最好，愈伤组织少，生根率74.66%，平均生根数3.02条。

2.4.2壮苗培养后对生根率的影响

将增殖阶段3厘米以上的嫩茎切下转接到添加0、0.25和0.5mg/L6-BA的壮苗培养基上，培养30天后，转接到1/2MS+IBA0.25mg/L+NAA0.1mg/L+0.2g/L活性炭且pH为6.5的生根培养基中，培养60天后，调查生根率见图1。图1可见，6-BA浓度为0和0.5mg/L的壮苗培养效果对生根率及生根条数的影响差异不大，但优于直接生根法;BA浓度0.25mg/L时的壮苗培养获得了最高的生根率(87.33%)和最佳的生根数(3.48条)。

3讨论

内生菌不能被一般的表面消毒方法所消除，它将随着材料进入培养过程，引起不同程度的污染，产生程度不一的危害，在早期往往会导致培养失败，增殖率降低，培养物生长减缓，玻璃化苗增加等;后期则导致试竹苗移栽困难和死亡。南天竹为常绿灌木，在外植体接种时往往因为消毒不彻底而将内生菌带入培养体系。

试验中，笔者采用添加青霉素G-K来抑制内生菌，虽有一定的抑制效果，但因青霉素不能高温灭菌而不能直接添加到培养基中，这为种苗工厂化繁殖生产带来了不便；50%的多菌灵可湿性粉剂能直接添加到培养基中进行高温灭菌，对南天竹的内生菌抑制有显著作用，且成本低廉。

培养基pH值及6-BA浓度对南天竹试管苗生根有一定的影响。本试验发现，较高的培养基pH值，有利于南天竹的生根。

壮苗培养后较直接生根能对生根率有较大程度的提高，说明植物体内吸收的高浓度细胞分裂素6-BA会对生根有一定的抑制作用;在壮苗阶段设置的6-BA3个浓度梯度后，试验结果也存在一定的差异，说明南天竹嫩茎的生根需要一定浓度比例的细胞分裂素协同植物生长素才能更好地刺激生根。

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