经典NaturemicroRNA

从事白癜风的临床研究 http://m.39.net/pf/a_5522607.html

撰稿

Ding

审校

Fu

有尾类和鱼类动物生命过程中的心脏再生以及刚出生的哺乳动物的心脏再生都是自发的1,2。再生过程中新的组织形成是由已经存在的心肌细胞部分去分化，再由这些去分化细胞增殖而形成3,4。而在成体哺乳动物中，心肌梗死(myocardialinfarction,MI)后心肌细胞增殖仅略有增加5，远低于临床相关水平。虽然在心肌梗死后对冠状动脉进行及时的插管和血管重建能够显著改善其预后，但也导致越来越多的存活患者出现永久性的心脏结构损害，这往往会导致心力衰竭。临床上对这种情况的治疗需求尚未得到满足，特别是考虑到心肌细胞由于不能增殖从而再生而丢失收缩组织6。因此，增强心肌细胞损伤后的内源性增殖能力是实现心脏修复的潜在策略。心肌细胞增殖受microRNA(miRNA)网络的控制7,8。高通量筛选工作发现，包括hsa-miR-a-3p在内的一些人类miRNAs，可以刺激啮齿类心肌细胞进入细胞周期，并刺激小鼠心肌梗死后的心脏再生9。年5月16日发表于Nature的文章MicroRNAtherapystimulatesuncontrolledcardiacrepairaftermyocardialinfarctioninpigs中，意大利研究人员将这些发现转化为猪的心肌梗死，作为一种临床相关的大型动物模型证明了人microRNA-a在梗死的猪心脏中的表达可以刺激心脏修复。该团队对心肌梗死的实验动物注射腺相关病毒载体来传递microRNA-a，一个月后，发现治疗的动物在整体和局部收缩能力、肌肉质量增加和瘢痕大小等方面都有显著改善。这些功能和形态学表现与心肌细胞去分化和增殖有关。然而，随后持续和不受控制的microRNA表达导致了大多数处理猪的突然心律失常死亡。这些事件与增殖细胞的心肌浸润同时发生，表现为分化较差的成肌细胞表型。这些结果表明，在大型哺乳动物中，通过刺激内源性心肌细胞增殖来实现心脏修复是可以实现的，但这种治疗的剂量需要严格控制。该研究首先确定了AAV6是心肌内注射后最有效的猪心肌细胞转导载体，并构建了一个在构成型CMV启动子的控制下表达hsa-miR-a-1pri-miRNA基因的AAV6载体。由pri-miRNA编码的micR-a-3p和miR-a-5p在大鼠、小鼠、猪和人类中是相同的。实验中采用的心肌梗死动物模型是在开胸手术后将猪的左冠状动脉前降支(LAD)与第一个斜支远端周围组织分离后用缝合线打结，使左冠状前动脉闭塞90min心脏发生缺血后再灌注。该实验将25只诱导了心肌梗死的猪随机分成两组，一组注射空载AAV6或相同剂量的AAV6-miR-a到左心室壁，另一组假手术动物作为对照组。通过定量PCR和原位杂交检测，研究发现注射区域的转导和转基因表达水平随着时间的推移稳定且持续，两个miRNA链的表达水平相当。同时也证实了一些已知的miR-a靶点在处理过的动物中被有效地下调，这说明构建的载体能够有效的表达miRNA并下调基因的表达。随后，基于晚期钆增强(LGE)图像(LGE-cMRI)的心脏磁共振成像(cMRI)对MI后的心脏进行形态学和功能评估。第28天通过红色复染识别发现在接受AAV6-miR-a的猪心横截面中疤痕（红色区域）大小明显减少，且梗死区域的纤维化区域明显减少。此外，注射AAV6-miR-a的动物的左室射血分数在28天后恢复，但相较于假手术组仍低20个百分点，同时注射AAV6-miR-a的动物的左心室的每搏输出量恢复与假手术组相同，这主要是由于AAV6-miR-a组的左室收缩末期容量部分恢复，而左室舒张末期容量没有改变。除了整体心功能外，cMRI还通过MRI标记来评估局部或节段收缩性。结果显示在心肌梗死28天后，AAV6-miR-a组的径向应变(ERR)和周向应变(ECC)均有显著恢复，同时左心室壁的厚度也恢复到假手术组水平，而空载AAV6组的恢复程度很低。但心脏形态和功能的改善是如何实现的呢？作者发现在损伤后第2天到18天向AAV6-miR-a组的猪心梗死边缘注射BrdU，Ki67阳性、含有BrdU、含有磷酸化组蛋白H3的心肌细胞数量增多。这些结果表明miR-a的表达促进内源性心肌细胞增殖，即心脏形态和功能改善与心肌细胞增殖增加相关。此外，在梗死边缘区，即AAV6-miR-a注射部位，研究者还发现有大量具有心肌细胞形态的细胞表达心脏发育必需的转录因子--GATA4。已有研究表明GATA4在斑马鱼心脏再生过程中会再次表达10。这些细胞的存在持续了28天，并且局限于注射的梗死边缘。持续的观察发现，一组（10只）用AAV6-miR-a治疗的梗死动物在治疗后8周，有3只猪在心脏形态和功能上继续显示出持续的有益影响，心脏疤痕逐渐减少。尽管这种渐进的形态和功能改善似乎能够完全使心脏恢复，但AAV6-miR-a组的10只猪中有7只在没有先前临床症状的情况下于第7-8周内猝死。通过皮下植入的微型记录器，研究者观察到猝死前心电图显示了由快速心律失常演变为心室纤颤的事件。然而，14种不同的离子通道或与各种类型的心律失常有关的相关蛋白的mRNA水平并没有揭示miR-a处理组动物和对照组动物之间的显著差异，这驳斥了miR-a可能直接影响控制心电活动的通道的可能性。研究者提出，这些快速心律失常可能是由于低分化心肌细胞区域的产生，低分化心肌细胞区域逐渐增大，最终决定致命的再入电路。或者，它们可能是由于miR-a-5p链在同一载体和促心脏再生miR-a-3p的同时表达而产生的，已知miR-a-5p链在心脏中发挥有害作用11,12。研究者为进一步探究实验对象猝死的原因，对注射了AAV6-miR-a的猪的组织切片，用苏木精和伊红染色，发现偶尔有小簇细胞浸润心肌。这些Ki67阳性细胞发生增殖并表达一些早期肌原性发育过程中存在的抗原，包括GATA4，肌原蛋白，钙调素结合蛋白和内皮素B型受体。此外，原位杂交显示，当这些小簇细胞被表达该miRNA的心肌细胞包围时，其miR-a呈阴性。因此，这些细胞要么在复制过程中丢失了AAV6载体（AAV6不能整合到宿主细胞基因组13），要么是表达AAV6-miR-a的心肌细胞诱导的微环境改变的结果。综上，研究者发现通过向心脏传递AAV6-miR-a可通过刺激心肌细胞去分化和增殖，减少梗死猪的梗死面积、减少心脏纤维化并改善收缩功能，然而，不受控制的、长期的miRNA表达最终导致大多数试验对象心源性猝死。因此，通过心脏给药促增殖的miRNA可以刺激心肌梗死后的心脏修复，但需要谨慎给药。这超出了目前病毒介导的基因转移的能力，但可以通过合成的miRNA模拟物无需载体直接进行心脏传递来实现。学习笔记：1.心脏再生过程中，新组织的形成是通过已经存在的心肌细胞的部分去分化，再由这些去分化细胞增殖而形成。2.miR-19a/19b能够增强心肌细胞增殖、刺激心肌梗塞后的心肌再生，使用腺相关病毒AAV递送miR-19a/19b，能够有效治疗心肌梗塞小鼠模型。但是miR-a可通过mTOR激活抑制自噬并诱导心肌肥厚，在心脏中发挥有害作用。3.GATA4是心脏发育所必需的转录因子，在斑马鱼心脏再生过程中GATA4会再次表达。

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