专业文川芎嗪治疗急性心肌梗死大鼠的作用机

作者

孙达，常静，林莉莉(无锡卫生高等职业技术学校药学系，江苏无锡)

来源

中国临床药理学杂志第35卷第24期年12月(总第期）-

摘要

目的探索川芎嗪对急性心肌梗死(AMI)大鼠的治疗作用及其调控机制。

方法用冠状动脉左前降支结扎方法构建AMI大鼠模型。将AMI模型大鼠随机分为模型组和低、中、高剂量实验组，每组10只。另取10只健康大鼠除不结扎冠状动脉外，其余手术方法同模型组，作为假手术组。造模成功后24h，低、中、高剂量实验组分别给予10，20和50mg·kg－1川芎嗪注射液，qd，腹腔注射;假手术组和模型组均给予等量0.9%NaCl溶液。连续干预4周后，检测各组大鼠的心功能相关指标、心肌损伤指标、心肌细胞凋亡及磷酸肌醇3－激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/低氧诱导因子－1α(HIF－1α)信号通路激活情况。

结果低、中、高剂量实验组和假手术组、模型组的左心室射血分数分别为(46.02±3.99)%，(53.55±4.10)%，(60.01±4.89)%，(78.33±5.92)%和(34.76±3.01)%，左室内压力变化最大上升速率分别为(.60±.34)，(.07±.23)，(.76±.90)，(.56±.12)和(.12±.30)mmHg·s－1，左室内压力变化最大下降速率分别为(.41±.42)，(.04±.11)，(.90±.82)，(.23±.12)和(.34±.23)mmHg·s－1，磷酸肌酸激酶同工酶分别为(97.11±7.68)，(72.04±7.21)，(51.10±3.88)，(33.20±2.92)和(.34±11.77)kU·L－1，心肌细胞凋亡率分别为(29.43±2.82)%，(21.80±2.19)%，(12.09±1.39)%，(3.22±0.22)%和(35.23±3.09)%，p－AKT的相对表达分别为(35.21±4.83)%，(51.89±7.12)%，(88.60±11.12)%，(.43±11.22)%和(13.89±1.83)%，HIF－1α的相对表达(.04±15.32)%，(72.44±10.39)%，(38.41±6.22)%，(87.04±5.12)%和(.88±12.44)%，模型组的上述指标与低、中、高剂量实验组和假手术组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

结论川芎嗪能够改善大鼠急性心肌梗死后的心功能损伤和心肌细胞凋亡，其作用机制可能与激活PI3K/AKT/HIF－1α信号通路有关。

关键词

川芎嗪;急性心肌梗死;心功能;细胞凋亡

中图分类号

Ｒ28

文献标志码

A

文章编号

－()24－－05

DOI

10./j.cnki.－..24.

急性心肌梗死(AMI)是世界范围内高发病率的严重心血管疾病，也是心源性猝死的主要原因[1]。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路在维持心脏功能方面发挥了重要作用[2]。激活PI3K/AKT通路有助于促进心肌梗死后的心肌细胞存活，其作用可能与增强低氧诱导因子-1α(HIF-1α)转录因子的表达有关[3]。川芎嗪具有扩张血管、抑制炎症、调节免疫及抗纤维化等药理作用[4-5]。本研究用结扎冠状动脉左前降支的方法构建AMI的大鼠模型，通过川芎嗪的干预治疗来观察其对AMI大鼠的影响并明确调控机制。

材料与方法1材料

动物雄性成年健康SD大鼠50只,体重(±20)g,8周龄,购自上海杰思捷实验动物有限公司?动物生产许可证号:SYXK(沪)-?

药品与试剂盐酸川芎嗪注射液,规格:每支2mL/40mg,批号:YY,国药准字:H,购自石家庄以岭药业股份有限公司?磷酸肌酸激酶(CK)?CK同工酶(CK-MB)检测试剂盒,均购自南京建成研究所;兔抗大鼠AKT,p-AKT,HIF-1α和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)第一抗体及山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体,均购自美国Abcam公司;原位末端凋亡(TUNEL)检测试剂盒,购自美国Roche公司?

仪器BL-A小动物心电图机,购自上海精密科学仪器有限公司;小动物多功能超声成像仪,购自南京科麟得科学仪器有限公司;全自动生化分析仪?iBright智能成像系统,均购自美国ThermoFisher公司;MPRO酶标仪,购自上海闪谱生物科技有限公司?

2实验方法

2.1模型构建大鼠适应性饲养7d后,参照CORRES等[6]的方法构建AMI模型?

2.2分组与给药方法将AMI模型大鼠随机分为模型组和低?中?高剂量实验组,每组10只?另取10只健康大鼠除不结扎冠状动脉外,其余手术方法同模型组?造模成功后24h,低?中?高剂量实验组分别给予10,20和50mg·kg-1川芎嗪注射液,qd,腹腔注射;假手术组和模型组均给予等量0.9%NaCl溶液?5组大鼠均连续干预4周?

2.3心功能指标检测干预4周后,给予3%戊巴比妥钠(30mg·kg-1)进行麻醉,用小动物多功能超声仪检测各组大鼠的左心室射血分数(LVEF)及左室内压力变化最大上升和下降速率(±dp/dtmax)?

2.4血清心肌损伤指标检测各组大鼠处死后,收集外周血,静置30min,待自然凝血后,以0r·min-1离心10min,分离血清,并用试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)?CK和CK-MB的含量,所有操作均按试剂盒说明书进行?

2.5心肌细胞凋亡情况检测用Tunel染色法检测各组大鼠的心肌细胞凋亡率,依次切片?脱蜡?水合?蛋白酶K常温处理30min,用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤后加入TUNEL试剂避光反应30min,用荧光显微镜观察心肌组织的染色情况并拍照,采集的图片用ImageJ分析,计算公式为心肌细胞凋亡率(%)=染色细胞数目/总细胞数×%?

2.6心肌组织中蛋白表达检测用蛋白免疫印迹法检测心肌组织中信号蛋白的相对表达?用手术剪取心肌组织约1g,加入RIPA裂解液μL裂解后,用BCA试剂测定蛋白总量,离心管放入沸水浴中5min进行蛋白变性?随后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电泳结束后蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入5%的脱脂奶粉进行室温封闭1h,后加入抗体稀释液稀释后的兔抗大鼠Akt,p-AKT,HIF-1α和GAPDH第一抗体(1∶0),4℃下过夜孵育,次日清洗后添加IgG二抗(1∶0),孵育1h后清洗,用电化学发光法曝光显色,用ImageJ软件定量分析蛋白相对表达水平?

3统计学处理

用GraphpadPrism6.0软件进行统计分析。计量资料用表示，计量资料经正态性检验符合正态分布后，各组间的差异比较用单因素方差分析、2组间的差异比较用t检验。

结果1TMP对大鼠心功能的保护作用与假手术组大鼠相比,模型组大鼠的LVEF?+dp/dtmax及-dp/dtmax均显著降低,差异均有统计学意义(均P0.01);经TMP干预治疗后,低?中?高剂量实验组大鼠的LVEF?+dp/dtmax和-dp/dtmax均较模型组显著增加,差异均有统计学意义(均P0.05)?TMP的干预作用具有显著的剂量依赖性?结果见表1?2TMP对大鼠血清心肌损伤指标的调节作用

与假手术组大鼠相比,模型组的血清LDH?CK-MB和CK含量均明显升高,差异均有统计学意义(均P0.01);经TMP干预治疗后,低?中?高剂量实验组大鼠的LDH?CK-MB和CK均较模型组显著降低,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)?TMP的干预作用具有显著的剂量依赖性?结果见表2?

3TMP对AMI大鼠心肌细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果显示,假手术组和模型组大鼠的心肌细胞凋亡率分别为(3.22±0.22)%和(35.23±3.09)%,差异有统计学意义(P0.05);低?中?高剂量实验组大鼠的心肌细胞凋亡率分别为(29.43±2.82)%,(21.80±2.19)%和(12.09±1.39)%,与模型组相比,差异均有统计学意义(均P0.05)?TMP的干预作用具有显著的剂量依赖性?结果见图1?

4TMP对大鼠心肌组织PI3K/AKT/HIF－1α信号通路的激活作用

假手术组和模型组大鼠心肌组织中p-AKT的相对表达分别为(.43±11.22)%和(13.89±1.83)%,HIF-1α的相对表达(87.04±5.12)%和(.88±12.44)%,模型组的上述指标和假手术组相比,差异均有统计学意义(均P0.05);低?中?高剂量实验组大鼠心肌组织中的p-AK的相对表达分别为(35.21±4.83)%,(51.89±7.12)%和(88.60±11.12)%,HIF-1α的相对表达(.04±15.32)%,(72.44±10.39)%和(38.41±6.22)%,低?中?高剂量实验组的上述指标与模型组相比,差异均有统计学意义(均P0.05)?TMP的干预作用具有显著的剂量依赖性?结果见图2?

讨论

TMP是从中药川芎中分离提纯得到的活性化合物,具有广泛的药理作用和临床应用[7-8]?本研究结果证实:TMP能够显著改善心脏功能,具有良好的抗炎作用,且能够显著抑制心肌细胞凋亡?对于TMP的抗凋亡作用也有类似的研究报道,如CHANG等[9]的研究证实,川芎嗪能够显著抑制大鼠永久性脑缺血中性粒细胞活化,改善脑梗死损伤?

研究表明[10],PI3K-AKT相关信号通路的激活参与了心肌细胞凋亡的调节?也有研究表明[11],HIF-1α作为PI3K-AKT的下游分子,参与了心肌细胞凋亡的调节,其通过影响细胞对缺氧或缺血的适应性反应,调节缺血/再灌注心肌细胞存活率?本研究结果证实,TMP干预能够激活PI3K-AKT通路,同时增强HIF-1α的表达,发挥抑制心肌细胞凋亡的作用?

因此,TMP能保护AMI大鼠的心脏功能,抑制心肌细胞凋亡,其保护作用依赖于PI3K/AKT和HIF-1α信号通路,提示TMP对AMI的干预治疗有重要的临床意义?

[参考文献]

[1]赵亚男,王晨,蔚有权,等.氯吡格雷联合阿司匹林治疗急性心肌梗死的临床研究[J].中国临床药理学杂志,,(31)8:-.

[2]KONGQ,DAIL,ZHANGX,etal.HSPA12Battenuatedacutemyocardialischemia/reperfusioninjuryviamaintainingendothelialintegrityinaPI3K/Akt/mTOR-dependentmechanism[J/OL].SciRep,,6:.-09-20[-10-10].

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