我国中性脂质储存病的多中心队列研究

01

摘要

背景：

中性脂质储存病(NLSDM)是一种罕见的临床异质疾病，由含铂样磷脂酶结构域2(PNPLA2)基因突变引起。NLSDM通常出现骨骼肌病、心肌病和多器官功能障碍。全世界约有50例NLSDM病例被描述过，而对这种疾病的全面了解仍然有限。因此，我们从中国10个中心招募NLSDM患者，总结临床、肌肉成像、病理和遗传特征，并分析基因型-表型关系。

结果：

从40个无关家庭中招募了45名NLSDM患者（18名男性和27名女性）。13名患者的父母是血亲血统的。这些表型分为无症状高钾血症（2/45）、纯骨骼肌病（18/45）、纯心肌病（4/45）以及骨骼肌病和心肌病的合并（21/45）。右上肢无力是61.5%患者早期的突出特征。在肌肉MRI中，股二头肌、大腿半膜和夹合肌、小腿腓肠骨和内侧头部表现出最严重的脂肪浸润。33个家族携带纯合子突变，而7个家族携带复合杂合子突变。共发现了23个突变，包括11个（47.8%）的点突变、8个（34.8%）的缺失和4个（17.4%）的插入。c+1GT、cGA和c+1GA是最常见的突变。在四组表型中，发病时（20年与≥20岁，p=0.）和肌肉病理学（有边缘液泡与无边缘液泡，p=0.）有显著差异。PNPLA2突变型或功能缺陷对表型没有很大的影响。

结论：

我们概述了一大群NLSDM患者的临床和遗传光谱。选择性肌肉腿部后腔间的脂肪浸润是NLSDM的特征。中国患者出现了独特的和相对热点的PNPLA2突变。边缘液泡的发病年龄和病理表现与临床表现有关。这些表型不受遗传缺陷的强烈影响，这表明在NLSDM的发展过程中有多种环境风险因素。

关键词：

中性脂质储存病肌病，斑脂样磷脂酶域含2，固定液泡、骨骼肌病、心肌病

02

工作背景资料

中性脂质储存疾病(NLSD)包括两种常染色体隐性遗传疾病。肌病的中性质储存疾病(NLSDM；MIM)是由铂样磷脂酶结构域含2(PNPLA2/ATGL)突变引起的，而中性质储存疾病的肌病(MIM)或Chanarin-多尔夫曼综合征是由比较基因鉴定-58(CGI-58/ABHD5)突变引起的。NLSDM通常影响骨骼和心脏肌肉，偶尔涉及肝脏、胰腺或大脑。NLSDM主要发生在30年代早期，在20岁之前很罕见。临床表型从高CK血症、肢体带/远端肌病或无心肌病到很少报道的纯心肌病都有所不同。肌肉磁共振成像(MRI)显示不对称脂肪渗透主要涉及肢体肌肉后腔。病理通常显示肌纤维中有或无边缘液泡(RVs)，以及外周血涂片中出现Jordan异常。PNPLA2突变主要位于c端，并倾向于聚集在外显子4到7中。家族内表型的受试者也有相同突变的变异性。全世界报告了大约50例NLSDM病例，来自不同民族，包括中国。然而，NLSDM患者通常在病例回顾或小群患者中被描述。NLSDM的罕见性和广泛的地理分布限制了对该疾病的全面理解和迅速诊断，表型/基因型相关性仍不清楚。在本研究中，我们从中国全国的神经肌肉中心招募了NLSDM患者。我们检查了临床概况、小腿肌肉MRI的脂肪替代模式、PNPLA2突变特征和表型/基因型相关性。

研究方法；

中国各地有10个中心同意参加NLSDM注册中心。诊断为致病性PNPLA2基因变异，其中乔丹在血液涂片或肌肉纤维中的脂质储存中有异常。临床数据收集包括发病年龄、性别、国籍、从发病到诊断时间、初始症状、骨骼肌无力分布、心脏和其他多器官功能障碍、肌酸激酶水平、电生理结果、心电图结果、超声和心脏核磁共振成像。所有患者均根据其发病年龄进行临床分类(20或≥20岁)及其表型（涉及骨骼肌或心肌肌肉）。

肌肉MRI成像；

3.0T下的肌肉核磁共振成像（GE1.5西格玛双速；美国威斯康星州华克夏市通用电气医疗保健）在大腿和小腿的轴向和冠状部分进行。在盆腔水平观察到最大臀肌。大腿中部有股直坐、股直坐、侧直坐、中直肌、中直肌、灰掌、长直肌、股二头肌、长头、半膜和半膜。在小腿中部观察到前胫、后胫、长趾伸肌、长腓骨、孤骨和腓胞肌内侧和侧头。根据修正的墨库里尺度（0-5尺度），采用轴向T1加权自旋回波序列（重复时间，ms/回波时间，ms）对脂肪渗透进行半定量评价。用/90（重复时间、ms/回波恢复时间，ms）来评估水肿程度（0-5量表）[23,24]。对于肌肉不对称，我们从腿部最严重的一侧选择了分数。

病理学；

在获得同意书后进行开放肌肉活检。组织标本立即冷冻在冷却的等戊烷中，并储存在液氮中。将标准组织学和组织化学技术应用于10μm冷冻切片，包括苏木精和蛋球蛋白、修饰毛森毛色、周期酸希夫反应、油红O、还原烟酰胺二核苷酸四唑还原酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素-c氧化酶反应、三磷酸腺酶（pH4.3、4.6和9.4）和非特异性酯酶。在一些患者中，部分标本在静止长度时固定在戊二醛中的2%中，并在静止长度后固定在渗透酸中进行电子显微镜检查。外周血液涂片用赖特或油红O染色，用光显微镜观察乔丹的异常。

基因检测

从外周血中提取基因组DNA，直接对PNPLA2基因(在8个家族包括F4、F9-13、F20、12/F22进行测序，或覆盖个与遗传性神经肌肉疾病相关基因（在剩下的32个家族）的靶向下一代测序。这些患者PNPLA2基因的X深度为%，20X深度为99.8-%，50X深度为95.8-%。如果通过下一代测序来确定这些变异，则使用桑格测序来确认这些发现。从父母那里采集血样，以明确变异的来源和测试的共同分离。这些基因变异由外显体聚集联盟、基因组聚集数据库和0个基因组项目(0G)进行了评估。利用PolyPhen2、突变品尝器和SIFT软件在硅功能分析中预测了错义变异体的影响。这些变异体最终根据美国医学遗传学和遗传学学院的指南进行了解释。分析了等位基因变异体的类型、频率和位置。

统计学分析；

比较多种变量，包括性别（男性对女性）、发病年龄（20岁与≥20岁）、肌肉病理（房车与无房车）、突变类型（纯合突变与杂合突变）和突变严重程度（有一个或两个零突变与框架义突变。对于统计分析，连续变量被描述为正态分布的平均±标准偏差，或作为偏态分布的中位数和四四分位范围(IQR)范围。使用卡方测试法测试了两组之间的差异。统计学意义被认为为p0.05。使用统计软件SPSS22.0(SPSS，Inc.，芝加哥，伊利诺斯州，美国)进行了所有数据的分析。

测试结果；

临床特征共从40个无关的家庭中招募了45名NLSDM患者（18名男性和27名女性）。所有的患者都来自中国大陆，分布在15个省和市，在中国东部很流行。1).汉族患者41例，董人2人，蒙古人2人。13名患者的父母是血亲血统的。发病年龄(IQR)为33岁。五个患者在20岁前有症状，在20岁后有40人有症状。从开始到诊断的中位数(IQR)时间为6（3,9）年。最初的症状包括肢体无力（36/45、80.0%）、运动不耐受（2/45、4.4%）、高钾血症（2/45、4.4%）、心悸（3/45、6.7%）、胸痛（1/45、2.2%）和听力损失（1/45、2.2%）。在36例肢体无力为第一症状的患者中，21例（58.3%）患者的右臂（15例患者）、右腿（3名患者）和右肢（3例患者）出现不对称无力。其余15名（41.7%）患者两臂（4例患者）、腿（5例患者）和四肢（6名患者）出现对称无力。诊断时，临床表型为纯骨骼肌病（18/.0%）、骨骼肌病（21/.7%）、纯心肌病（4/.9%）和无症状高钾血症（2/.4%）。在39例骨骼肌病患者中或有无肌病患者中，所有患者均出现肢体无力（%）。25/39（64.1%）患者出现颈部屈曲无力。没有发现球部麻痹或呼吸功能不全。肌肉无力主要涉及33/39（84.6%）患者的近端无力，6/39（15.4%）患者的远端无力。24/39（61.5%）患者出现不对称无力，所有患者均显示右臂参与程度最突出。15/39（38.5%）患者出现对称肢体无力，其中9例患者手臂最突出，6条腿最突出。30/39（76.9%）患者出现弥漫性肌萎缩，22/39（56.4%）患者出现肩胛骨摆动。其他器官功能障碍包括听力丧失（.2%）、身材矮小（.6%）、高血压（.3%）、糖尿病（24.4%）、肝肿大（24.4%）、急性坏死性胰腺炎（24.4%）、智力障碍（12.2%）、白内障（12.2%）和腹泻（12.2%）。45例患者的血清肌酸激酶水平范围为正常到上限的25倍（正常范围为25-IU/L）。针肌电图显示39/43（90.7%）患者的肌病理变化，1例神经源性患者（2.3%），3例患者正常（7.0%）。三例（7.0%）病例显示肌力力出院。11/43例（25.6%）患者神经传导异常，6例（14.0%），2例（4.7%）和3例（7.0%）患者神经传导异常。三例（7.0%）病例表现为多种神经病态。8例复合肌动作电位下降，1例感觉神经动作电位降低。传导速度为显示有两种病例的感觉神经在下降。胫骨神经H反射反应消失。心电图显示12/45例患者（26.7%）患者出现异常，包括5例ST-T段升高，1例阵发性房颤，左前束传导阻滞，2例淋巴结性心动过速2例心动过缓，1例非持续室性心动过速，1例老年心肌梗死（p39），冠状动脉造影中未显示任何动脉狭窄。超声心电图显示，13/35例患者（28.9%）出现心肌病，其中10例出现肥厚性患者，3例出现扩张型心肌病，其中5人被心脏核磁共振成像进一步证实。

肌肉MRI特征；

21名患者大腿进行核磁共振，小腿进行16名。5例患者观察到脂肪浸润不对称，两例患者右肢和3例患者左肢表现明显。19/21（90.5%）患者的大腿上出现脂肪浸润。在MRI评分分析中，股二头肌、半膜肌和长肌是受到严重影响的前三名肌肉。女性直坐肌、灰掌和腹肌是前三名参与最少的肌肉。16/16（%）患者的下肢出现脂肪浸润。前两个严重渗透的肌肉是腓肠肌的独处骨和内侧头部。浸润最小的肌肉是前胫肌和后胫肌。2、图2。3、附加文件1）。19/21（90.5%）患者的大腿出现肌肉水肿，主要涉及股二头肌、最大臀肌和肌掌肌。龙、龙和龙相对幸免。16/16（%）患者的下肢出现肌肉水肿，主要涉及腓肠肌内侧头部和孤骨。前胫肌、长指伸肌和短腓骨肌是受影响最小的三块肌肉。没有观察到不对称的肌肉水肿。来自肌肉病理学和外周血涂片的数据从42例患者中获得了肌肉标本。活检的部位是40例患者的二头肌，一名患者的四头肌（p45），一名患者的三角肌（p39）。18例（42.9%)患者报告纤维脂肪置换，24例(57.1%）纤维大小变化，19例肌纤维坏死和再生，所有患者脂滴积累。在21例（50.0%）的患者中发现了房车，其中包括20例来自二头肌的标本和1例来自四头肌的标本。16例患者表现为近端肌病，5例患者表现为远端肌病。外周血涂片显示，所有31例测试患者都有乔丹的异常。PNPLA2基因突变：频率和类型在来自NLSDM40个家族的45名患者中，33个家族携带了纯合子突变，而7个这些家族携带着复合杂合子突变。来自14个家庭的变异体已被证实存在共同隔离。共发现了23个突变，包括11个（47.8%）点突变、8个（34.8%）缺失和4个（17.4%）插入，这在功能上导致11个（47.8%）移码缺失、1个（4.3%）帧内缺失、4个（17.4%）剪接突变、6个（26.1%）错义突变和一个同义突变（4.3%）。在来自40个家族的80个等位基因变异体中，约+1GT（24/80,30.0%），c.GA（9/80,11.3%）和c.+1GA（8/80,10.0%）是前三个突变，占等位基因频率的一半以上。纯合子c+1GT是热点突变。13例携带约+1GT纯合或杂合突变的患者，分布在中国南部和北部(图。1).6个错义突变中有5个位于帕塔丁结构域（氨基酸10-），其余的是一个错义突变和一个同义突变位于四磷脂质和疏水脂质之间结合结构域（氨基酸-）。c.GA、c.TC、c.CA、c.GA和c.CG在突变品尝者中致病，可能在多芬2中破坏，在SIFT中有害。c.C在突变品尝器中呈多态性，多芬2良性，SIFT有害。根据ACMG，15个零突变（4个剪接和11个缺失/插入）被判断为致病性或可能具有致病性。c._del的纯合子次线突变和六种错义突变被解释为意义不确定。c.GA的同义突变也被解释为不确定的意义，因为它是使用人剪接查找剂3.1(

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